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作為實驗室常見的分析手段之一，高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”等。由高效液相色譜原理設(shè)計而成的機(jī)器，即我們在做分析實驗中經(jīng)常使用的高效液相色譜儀。HPLC主要用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物等。
HPLC的檢測流程和原理：在檢測系統(tǒng)中，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于不同的分配系數(shù)，經(jīng)過反復(fù)多次的“吸附-解吸”的分配過程，樣品溶液中組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，終數(shù)據(jù)以圖譜形式輸出。
在樣品溶液中，不可避免的會有雜質(zhì)，這時候就要引進(jìn)“相對響應(yīng)因子”和“相對校正因子”的概念。
相對響應(yīng)因子(RRF)一般應(yīng)用于原料藥或者藥物制劑色譜分析方法中，對有關(guān)物質(zhì)(如雜質(zhì)或者降解雜質(zhì))的精確定量或者活性藥物原料(API)的純度檢查。作為重要的色譜方法學(xué)參數(shù)，RRF的值取決于化合物本身的紫外吸收光譜性質(zhì)以及檢測器波長，準(zhǔn)確的RRF值對相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)研究非常重要。
相對校正因子的計算方法為：
F=(A雜/C雜)/(A樣/C樣)
在中國藥典中，“加校正因子的主成分自身對照法”規(guī)定計算方法為：
色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質(zhì)含量。這里規(guī)定的“校正因子”計算方法是按內(nèi)標(biāo)法校正因子：
F=(A內(nèi)標(biāo)/C內(nèi)標(biāo))/(A對照/C對照)
相對響應(yīng)因子(RRF)與校正因子F的關(guān)系如下：
F=1/RRF= Slope 主峰/ Slope imp
其中：Slope imp是指對應(yīng)雜質(zhì)的斜率，Slope 主峰是指主峰的斜率。
需要注意的是，相對響應(yīng)因子的數(shù)值不是一成不變的，一種物質(zhì)在某種特定條件下，它的相對響應(yīng)因子是針對自身而言的，如果條件改變，則響應(yīng)因子數(shù)值也有可能改變。
在使用HPLC時，應(yīng)當(dāng)考慮相對相應(yīng)因子的影響，以免對數(shù)值造成誤差過大。
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